Interazione dei virus con le cellule ospiti e riproduzione dei virus.
I virus attraversano un complesso ciclo di sviluppo nella cellula. La morfogenesi dei virus è la fase principale di questo sviluppo e consiste in processi di morfogenesi che portano alla formazione di un virione come conclusione della forma di sviluppo del virus. L'ontogenesi e la riproduzione dello sviluppo del virus sono regolate dal genoma.
Negli anni '50 si stabilì che la riproduzione del virus avviene per riproduzione, ad es. riproduzione di nucleici e proteine con successivo assemblaggio del virione. Questi processi si verificano in diverse parti della cellula, ad esempio nel nucleo e nel citoplasma (modalità di riproduzione disgiuntiva). La riproduzione virale è una forma unica di espressione di un'infezione estranea nelle cellule di esseri umani, animali, insetti e batteri.
La morfogenesi è regolata da geni morfogenetici. Esiste una relazione diretta tra la complessità dell'ultrastruttura del virione e la sua morfogenesi. Più complessa è l'organizzazione del virione, più lungo è il percorso di sviluppo attraversato dal virus. L'intero processo viene eseguito con l'aiuto di enzimi speciali. Perché I virus non hanno un proprio metabolismo, hanno bisogno di enzimi. Tuttavia, nei virus sono stati trovati più di 10 enzimi di diversa origine e significato funzionale.
Per origine: virione, indotto da virus, cellulare, modificato da virus. I primi fanno parte di molti virus contenenti DNA e RNA. RNA polimerasi DNA-dipendente, protein chinasi, ATPasi, ribonucleasi, RNA polimerasi RNA-dipendente, esonucleasi e altri.
Le forme del virione includono: emoglutinina e neuraminidasi, lisozima.
Gli enzimi che inducono virus sono enzimi la cui struttura è codificata nel genoma e la sintesi avviene sul ribosoma ospite - le prime proteine del virione.
Cellulare: include gli enzimi della cellula ospite, non sono specifici del virus, tuttavia, quando interagiscono con i virus, l'attività può essere modificata.
In base al loro significato funzionale, gli enzimi sono divisi in 2 gruppi:
- --- Coinvolto nella replica e nella trascrizione;
- --- Neuraminidasi, lisozima e ATP-asi, che contribuiscono alla penetrazione del virus nella cellula e al rilascio di virioni maturi dalla cellula.
La riproduzione dei virioni è caratterizzata da un cambio di stadio:
La trascrizione - la riscrittura del DNA in RNA - viene effettuata utilizzando l'enzima RNA polimerasi, i prodotti sono la biosintesi dell'mRNA. I virus contenenti DNA che si riproducono nel nucleo utilizzano una polimerasi cellulare per la trascrizione. contenente RNA virus f-yu L'mRNA è svolto dal genoma stesso. Alcuni virus a RNA trasmettono informazioni genetiche effettuata secondo la formula RNA-RNA-proteina. Questo gruppo di virus include: picornovirus, cornovirus.
La sintesi proteica avviene come risultato della traduzione in RNA.
Secondo i dati moderni, ci sono 3 periodi principali nel ciclo riproduttivo:
- 1. Iniziale (preparatoria)
- 2. Medio (latente)
- 3. Finale (finale)
Ciascuno dei periodi comprende una serie di fasi:
Primo stadio
- 1. Adsorbimento del virus sulla cellula.
- 2. Penetrazione nella cellula.
- 3. Deproteinizzazione (rilascio di acido nucleico).
Seconda fase
- 1. Biosintesi delle prime proteine virali
- 2. Biosintesi di componenti virali
Terza fase
- 1. Formazione di virioni maturi
- 2. Rilascio di virioni maturi dalla cellula.
1. Adsorbimento - un processo fisico e chimico, è una conseguenza della differenza di carica. Questa fase è reversibile, il suo esito è influenzato dall'acidità del mezzo, dalla temperatura e da altri processi.
Il ruolo principale nell'adsorbimento del virus è svolto dall'interazione del virus con i recettori cellulari complementari. Per natura chimica, appartengono alle mucopoliproteine. Il grado di velocità di adsorbimento è influenzato dagli ormoni che agiscono sui recettori. L'assorbimento del virus potrebbe non verificarsi, a causa della diversa sensibilità delle cellule ai virus. La sensibilità, a sua volta, è determinata da:
- - la presenza nella membrana cellulare e nel citoplasma di enzimi in grado di distruggere la membrana e rilasciare acido nucleico.
- - la presenza di enzimi, materiale che assicura la sintesi delle componenti virali.
- 2. Penetrazione del virus nella cellula:
Il virus penetra in 3 modi: per iniezione diretta (tipico per i fagi); distruggendo la membrana cellulare (percorso di fusione - tipico dei virus vegetali); per pinocitosi (caratteristica dei virus dei vertebrati).
3. Riproduzione di virus contenenti DNA.
Sotto l'influenza degli enzimi nei virus contenenti DNA, l'mRNA viene sintetizzato e l'mRNA viene inviato ai ribosomi di una cellula sensibile. Sui ribosomi della cellula inizia la sintesi delle prime proteine del virione (dotate di proprietà - enzimi, blocco del metabolismo cellulare).
Le prime proteine del virione danno luogo alla formazione dei primi acidi del virione.
Quando le prime proteine del virione si accumulano, si bloccano e il processo viene riorganizzato sull'apparato ribosomiale. I virioni vengono assemblati e i virioni appena formati lasciano la cellula madre.
4. Uscita del virione dalla cella:
1. Filtrano attraverso la membrana cellulare e si vestono con un supercapside, che include componenti cellulari: lipidi, polisaccaridi. In questo caso, la cellula mantiene la sua attività vitale e poi muore. In alcuni casi, nel processo di riproduzione, i processi possono verificarsi per diversi anni, ma l'attività vitale viene preservata. Con questo metodo, i virioni maturi lasciano la cellula gradualmente e per un tempo relativamente lungo. Questo percorso è tipico per i virus complessi che hanno una doppia shell.
virus anormali.
Nel processo di riproduzione si formano vari virus anormali. Grazie agli sforzi dell'accademico Zhdanov, negli ultimi anni sono stati scoperti pseudovirus, costituiti da un virus a RNA e proteine cellulari che formano un capside. Hanno proprietà infettive, ma a causa della particolarità del capside, non sono suscettibili all'azione degli anticorpi che formano una risposta a questo virus.
Il fenomeno della formazione di tali virus è spiegato dal trasporto di virus a lungo termine in presenza di anticorpi specifici nel corpo.
Le ragioni per la formazione di tali virioni sono:
- 1. Elevata molteplicità, a causa della quale la cellula non è in grado di fornire materiale energetico a tutta la prole.
- 2. L'azione dell'interferone: influisce sulla sintesi dei virus del DNA e dell'RNA.
1. Adsorbimento: il processo di attacco delle particelle virali alla superficie cellulare.
2. Iniezione - la penetrazione di una particella virale nella cellula e il rilascio di NK virale dal capside proteico (nei batteriofagi - l'introduzione di NK nella cellula).
3. Replicazione delle molecole NK virali - si verifica a causa dei nucleotidi nella cellula.
4. Sintesi di proteine virali (proteine capside ed enzimi) - si verifica sui ribosomi della cellula.
5. Assemblaggio di particelle virali - viene effettuato dal NK virale e dalle proteine virali sintetizzate dalla cellula interessata.
6. Rilascio di particelle virali dalla cellula colpita. Nei batteri, è spesso accompagnata da lisi (distruzione) della cellula; negli eucarioti, si verifica per protrusione della membrana cellulare e "spingendo" le particelle virali nell'ambiente. In generale, ci sono 3 modi: a) litico (tutti i virus entrano nell'ambiente esterno, la cellula muore), b) persistente (rilascio graduale), c) latente (le cellule non rilevano il virus per qualche tempo).
1. Microrganismi. Tipi di microrganismi. Classificazione dei microrganismi. Prioni.
2. Virus. virione. Morfologia dei virus. Dimensioni dei virus. acidi nucleici dei virus.
3. Capside del virus. Funzioni del capside dei virus. Capsomeri. Nucleocapside virale. Simmetria elicoidale del nucleocapside. Simmetria cubica del capside.
4. Supercapside virale. Virus travestiti. Virus nudi. Proteine della matrice (proteine M) dei virus. riproduzione dei virus.
5. Interazione di un virus con una cellula. La natura dell'interazione virus-cellula. Interazione produttiva. Virogenesi. Interferenza del virus.
7. Penetrazione del virus nella cellula. Viropessi. Spogliare il virus. Fase ombra (fase di eclissi) della riproduzione del virus. La formazione di particelle virali.
8. Trascrizione del virus nella cellula. Traduzione di virus.
9. Replicazione del virus nella cellula. Raccolta di virus. Rilascio di virioni di progenie dalla cellula.
Secondo la natura dell'interazione del genoma del virus con il genoma cellulare, autonomo(il genoma del virus non è integrato nel genoma della cellula) e integrazione(genoma virale integrato nel genoma cellulare) infezione. Una forma speciale è infezione latente e persistente.
Infezione latente di cellule da virus. Il DNA di alcuni virus (herpesvirus, retrovirus) può trovarsi nella cellula al di fuori dei cromosomi, oppure il DNA virale è integrato nel genoma nucleare, ma non si verificano sintesi virus-specifiche. Questo DNA virale forma un provirus latente che si replica insieme al cromosoma. Tali stati del DNA virale sono instabili, sono possibili riattivazioni periodiche con il passaggio a un'interazione produttiva "virus-cellula", oppure la cellula si trasforma, dando luogo a una crescita maligna.
Infezione persistente di cellule con virus. Alcuni virus a RNA possono causare infezioni persistenti, manifestate dalla formazione di popolazioni figlie del patogeno dopo la fine della fase acuta della malattia. In questo caso si verifica un rilascio graduale di particelle virali, ma la cellula infetta non viene lisata. Spesso, le popolazioni di progenie di virioni sono difettose (spesso osservate in individui immunocompromessi). A volte tali lesioni croniche si verificano senza manifestazioni cliniche. In particolare, il virus dell'epatite B è in grado di provocare danni persistenti agli epatociti con lo sviluppo di epatite cronica; in futuro, è possibile la malignità delle cellule.
Il ciclo riproduttivo dei virus
Mostrato in fig. 2-3 fasi della riproduzione(dall'adsorbimento dei virioni al rilascio della popolazione figlia) si verificano durante l'interazione produttiva del virus con la cellula.
Riso. 2-3. Le fasi principali della riproduzione del virus.
Adsorbimento del virione alla cellula
La prima fase del ciclo riproduttivo è adsorbimento di virioni sulla superficie della cellula infetta. L'adsorbimento avviene attraverso l'interazione del virione con specifici recettori cellulari. Le proteine che compongono il capside o supercapside sono responsabili del riconoscimento dei recettori. Pertanto, il concetto di "tropismo virale" è spiegato dall'interazione specifica delle proteine virali con i recettori di superficie della cellula infetta. Ad esempio, il poliovirus entra e si replica nelle cellule del sistema nervoso centrale (SNC) e del tratto gastrointestinale (GIT), poiché negli esseri umani e nei primati solo queste cellule hanno recettori per le proteine del poliovirus,
processo di adsorbimento non dipende dalla temperatura (cioè non richiede costi energetici) e scorre in due fasi; la fase di attrazione ionica è dovuta all'interazione aspecifica, la fase di attaccamento avviene per omologia strutturale o complementarietà delle molecole interagenti.
Il numero di particelle virali infettive adsorbite sulla cellula definisce il termine " molteplicità di infezioni» (infezione). Di solito, una cellula animale contiene circa 50.000 recettori e la sua infezione è di natura multipla, cioè un gran numero di virioni può essere adsorbito sulla cellula. Tuttavia, una cellula infetta da virus è solitamente tollerante alla reinfezione con un virus omologo.
I virus sono caratterizzati da un metodo di riproduzione-moltiplicazione disgiuntivo (da disjuncus - disunito). La progenie del virus nasce come risultato dell'assemblea acidi nucleici e subunità proteiche, che sono sintetizzate separatamente dalla cellula ospite.
La penetrazione del virus nella cellula e la riproduzione della sua specie avviene in più fasi:
1.penetrazione cellula ospite,
2.sintesi degli enzimi necessari alla replicazione degli acidi nucleici virali,
3.sintesi di parti virali,
4. assemblaggio e composizione di virioni maturi,
5. rilascio di virioni maturi dalla cellula.
fasi della riproduzione virale.
1 - adsorbimento del virione sulla cellula; 2 - penetrazione del virione nella cellula mediante viropessi;
3 - virus all'interno del vacuolo della cellula; 4 - `svestizione del virus virione; 5 - replicazione dell'acido nucleico virale; 6 - sintesi di proteine virali su ribosomi cellulari; 7 - formazione del virione; 8 - uscita del virione dalla cellula per gemmazione.
Fase I - adsorbimento del virione sulla superficie cellulare.
Si procede in due fasi: il primo non è specifico, quando il virus è trattenuto sulla superficie della cellula con l'aiuto di forze elettrostatiche, cioè a causa della comparsa di cariche opposte tra le singole sezioni della membrana cellulare e il virus. Questa fase dell'interazione del virus con la cellula è reversibile, è influenzata da fattori come il pH e la composizione salina del mezzo.
La seconda fase è specifica quando interagiscono specifici recettori virali e recettori cellulari complementari tra loro. Per natura chimica, i recettori cellulari possono essere mucoproteine (o mucopolisaccaridi) e lipoproteine. Diversi virus sono fissati su diversi recettori: virus dell'influenza, parainfluenza, adenovirus - sulle mucoproteine e virus dell'encefalite da zecche, poliomielite - sulle lipoproteine.
Fase II - ingresso del virus nella cellula. Le osservazioni elettronoscopiche del processo di penetrazione dei virus nelle cellule ad essi sensibili hanno mostrato che viene effettuato attraverso un meccanismo simile alla pinocitosi o, come viene più comunemente chiamato, viropessi. Nel sito di adsorbimento del virus, la parete cellulare viene aspirata nella cellula, si forma un vacuolo, in cui si trova il virione. Parallelamente, gli enzimi cellulari (lipasi e proteasi) causano la deproteinizzazione del virione - la dissoluzione del guscio proteico e il rilascio dell'acido nucleico.
Fase III - periodo di latenza (periodo di eclissi - scomparsa). Durante questo periodo, è impossibile determinare la presenza di un virus infettivo nella cellula con metodi chimici, al microscopio elettronico o sierologici. Poco si sa sulla natura di questo fenomeno e sui suoi meccanismi. Si presume che nella fase latente l'acido nucleico del virus penetri nei cromosomi della cellula ed entri in complesse relazioni genetiche con essi.
Fase IV - sintesi di componenti del virione. In questa fase il virus e la cellula sono un tutt'uno, l'acido nucleico virale svolge una funzione genetica, induce la formazione di proteine precoci e modifica la funzione dei ribosomi. Le prime proteine si dividono in:
un) proteine inibitorie(repressori) che inibiscono il metabolismo cellulare
b) proteine enzimatiche(polimerasi), fornendo la sintesi degli acidi nucleici virali.
La sintesi degli acidi nucleici e delle proteine avviene in modo non simultaneo e in diverse parti strutturali della cellula. Nei virus contenenti DNA o RNA, questi processi presentano alcune differenze e caratteristiche.
Fase V - formazione di virioni maturi. Il processo di "assemblaggio" del virus viene eseguito a seguito della connessione dei componenti della particella del virus. Nei virus complessi, le strutture cellulari prendono parte a questo processo e si verifica l'inclusione di componenti lipidici, carboidrati e proteici della cellula ospite nella particella virale.
Il processo di formazione dei virioni inizia dopo un certo tempo dall'inizio della sintesi dei loro componenti costitutivi. La durata di questo periodo è abbastanza variabile ed è predeterminata dalla natura del virus: per i virus contenenti RNA è solitamente più breve che per i virus a DNA. Ad esempio, la produzione di particelle di virus vaccinia completo inizia circa 5-6 ore dopo l'infezione delle cellule e continua per le successive 7-8 ore, cioè dopo che la sintesi del DNA virale è già stata completata.
Si formano legami molto forti tra l'acido nucleico e le corrispondenti subunità proteiche, come evidenziato dalla difficoltà nel separare la proteina dall'acido nucleico virale. La maggiore forza della particella virale è data dai suoi carboidrati costituenti e soprattutto dai lipidi.
La formazione dei virioni, così come la sintesi dei componenti del virus, avviene in luoghi differenti cellule, con la partecipazione di varie strutture cellulari. Dopo il completamento del processo di formazione, si forma una particella virale figlia matura, che ha tutte le proprietà del virione genitore. Ma a volte c'è la formazione dei cosiddetti virus incompleti, che consistono o solo di acido nucleico, o di proteine, o di particelle virali, la cui formazione è cessata in qualche stadio intermedio.
Fase VI - rilascio di virioni maturi dalla cellula. Esistono due meccanismi principali per il rilascio di virioni maturi dalla cellula:
1) uscita del virione per gemmazione. In questo caso, l'involucro esterno del virione è derivato dalla membrana cellulare e contiene sia materiale della cellula ospite che materiale virale;
2) uscita di virioni maturi dalla cellula attraverso lacune nella membrana. Questi virus non hanno un guscio esterno. Con un tale meccanismo per il rilascio di virus, la cellula, di regola, muore e nel mezzo appare un gran numero di particelle di virus.
La morte di una cellula infetta può essere causata da tre meccanismi:
1. il lavoro del virus, "depauperando" la cellula;
2. reazione protettiva della cellula, che innesca il programma genetico della sua morte (apoptosi);
3. il sistema immunitario del corpo, distruggendo la cellula infetta.
Oltre al tipo produttivo di interazione tra il virus e la cellula, è possibile convivenza integrativa o virogenicità. La virogenicità è caratterizzata dall'integrazione (inclusione) dell'acido nucleico del virus nel genoma cellulare, nonché dalla replicazione e dal funzionamento del genoma virale come parte integrante del genoma cellulare. L'integrazione con il genoma cellulare richiede l'emergere di una forma circolare di DNA a doppio filamento del virus. Il DNA virale incorporato nel cromosoma di una cellula è chiamato provirus. Il provirus si replica all'interno del cromosoma e passa nel genoma delle cellule figlie, cioè lo stato di virogeneità è ereditato. Sotto l'influenza di alcuni fattori fisici o chimici, il provirus può entrare in uno stato autonomo con lo sviluppo di un tipo produttivo di interazione con la cellula. Ulteriori informazioni genetiche del provirus durante la virogenicità conferiscono nuove proprietà alla cellula, che possono essere la causa dello sviluppo di tumori, malattie autoimmuni e croniche. La capacità dei virus di integrarsi con il genoma cellulare è alla base della persistenza (dal latino persisto - rimanere, rimanere) dei virus nell'organismo e lo sviluppo di infezioni virali persistenti. Ad esempio, il virus dell'epatite B può causare lesioni persistenti con lo sviluppo di epatite cronica e spesso tumori del fegato.
Il processo di riproduzione dei virus può essere suddiviso condizionatamente in 2 fasi . La prima fase comprende 3 fasi: 1) adsorbimento del virus su cellule sensibili; 2) penetrazione del virus nella cellula; 3) deproteinizzazione del virus . La seconda fase comprende le fasi di realizzazione del genoma virale: 1) trascrizione, 2) traduzione, 3) replicazione, 4) assemblaggio, maturazione delle particelle virali e 5) rilascio del virus dalla cellula.
L'interazione di un virus con una cellula inizia con il processo di adsorbimento, cioè con l'attaccamento del virus alla superficie della cellula.
Adsorbimentoè un legame specifico di una proteina virione (antirecettore) a una struttura della superficie cellulare complementare - un recettore cellulare. Per natura chimica, i recettori su cui sono fissati i virus appartengono a due gruppi: mucoproteine e lipoproteine. Virus dell'influenza, parainfluenza, adenovirus sono fissati sui recettori delle mucoproteine. Enterovirus, herpes virus, arbovirus vengono adsorbiti sui recettori lipoproteici della cellula. L'adsorbimento avviene solo in presenza di determinati elettroliti, in particolare ioni Ca2+, che neutralizzano le cariche anioniche in eccesso del virus e della superficie cellulare e riducono la repulsione elettrostatica virus e cellula, quindi avviene l'interazione specifica della proteina di attacco del virione con gruppi specifici sulla membrana plasmatica della cellula. Semplici virus umani e animali contengono proteine di attaccamento nel capside. Nei virus organizzati in modo complesso, le proteine di attaccamento fanno parte del supercapside. Possono assumere la forma di fili (fibre negli adenovirus) o punte, strutture simili a funghi nei virus mixo, retro, rabdo e altri. Inizialmente, si verifica un singolo legame del virione con il recettore - tale attaccamento è fragile - l'adsorbimento è reversibile. Affinché si verifichi un adsorbimento irreversibile, devono comparire legami multipli tra il recettore del virus e il recettore cellulare, cioè un attaccamento multivalente stabile. Il numero di recettori specifici sulla superficie di una cellula è 10 4 -10 5 . Recettori per alcuni virus, come gli arbovirus. si trovano su cellule sia di vertebrati che di invertebrati; per altri virus, solo su cellule di una o più specie.
La penetrazione di virus umani e animali nella cellula avviene in due modi: 1) viropessi (pinocitosi); 2) fusione dell'involucro del supercapside virale e membrana cellulare. I batteriofagi hanno un proprio meccanismo di penetrazione, la cosiddetta siringa, quando, a seguito della contrazione della crescita proteica del fago, l'acido nucleico viene, per così dire, iniettato nella cellula.
La deproteinizzazione del rilascio del virus dell'emioma virale dai gusci protettivi virali avviene con l'aiuto di enzimi virali o con l'aiuto di enzimi cellulari. I prodotti finali della deproteinizzazione sono acidi nucleici o acidi nucleici associati a una proteina virale interna. Quindi ha luogo la seconda fase della riproduzione virale, che porta alla sintesi dei componenti virali.
La trascrizione è la riscrittura di informazioni dal DNA o RNA di un virus all'mRNA secondo le leggi del codice genetico.
La traduzione è il processo di traduzione dell'informazione genetica contenuta nell'mRNA in una specifica sequenza di aminoacidi.
La replicazione è il processo di sintesi di molecole di acido nucleico omologhe al genoma virale.
L'implementazione delle informazioni genetiche nei virus contenenti DNA procede allo stesso modo delle cellule:
Trascrizione del DNA e proteina di traduzione dell'RNA
Trascrizione dell'RNA e proteina di traduzione dell'RNA
Nei virus con genoma RNA positivo (togavirus, picornavirus), la trascrizione è assente:
Proteina di traduzione dell'RNA
I retrovirus hanno un modo unico di trasferire le informazioni genetiche:
Trascrizione inversa dell'RNA Trascrizione del DNA Proteina di traduzione dell'i-RNA
Il DNA si integra con il genoma della cellula ospite (provirus).
Dopo che la cellula ha prodotto componenti virali, inizia l'ultima fase della riproduzione virale, l'assemblaggio delle particelle virali e il rilascio di virioni dalla cellula. Il rilascio di virioni dalla cellula avviene in due modi: 1) per "esplosione" della cellula, a seguito della quale la cellula viene distrutta. Questo percorso è inerente ai virus semplici (picorna, reo, papova e adenovirus), 2) escono dalle cellule per gemmazione. Inerente ai virus contenenti supercapside. Con questo metodo, la cellula non muore immediatamente, può dare più prole virale fino a quando le sue risorse non si esauriscono.
Metodi di coltura del virus
Per la coltivazione di virus in condizioni di laboratorio vengono utilizzati i seguenti oggetti viventi: 1) colture cellulari (tessuti, organi); 2) embrioni di pollo; 3) animali da laboratorio.
Colture cellulari
Le più comuni sono le colture cellulari a strato singolo, che possono essere suddivise in 1) primarie (principalmente tripsinizzate), 2) semi-trapiantabili (diploidi) e 3) trapiantabili.
Origine si classificano in embrionali, neoplastici e da organismi adulti; per morfogenesi- su fibroblasti, epiteliali, ecc.
Primario le colture cellulari sono cellule di qualsiasi tessuto umano o animale che hanno la capacità di crescere come un monostrato su una superficie di plastica o vetro rivestita con uno speciale mezzo nutritivo. La durata di tali colture è limitata. In ogni caso, sono ottenuti dal tessuto dopo macinazione meccanica, trattamento con enzimi proteolitici e standardizzazione del numero di cellule. Le colture primarie derivate da reni di scimmia, reni embrionali umani, amnios umano, embrioni di pollo sono ampiamente utilizzate per l'isolamento e l'accumulo di virus, nonché per la produzione di vaccini virali.
semitrapiantabile (o diploide ) colture cellulari - cellule dello stesso tipo, in grado di resistere fino a 50-100 passaggi in vitro, pur mantenendo il loro set diploide originale di cromosomi. I ceppi diploidi di fibroblasti embrionali umani sono utilizzati sia per la diagnosi di infezioni virali che per la produzione di vaccini virali.
trapiantato le linee cellulari sono caratterizzate da potenziale immortalità e cariotipo eteroploide.
La fonte delle linee trapiantate può essere colture cellulari primarie (ad esempio SOC, PES, VNK-21 - dai reni di criceti siriani di un giorno; PMS - dal rene di una cavia, ecc.), Di cui singole cellule mostrano una tendenza alla riproduzione infinita in vitro. La totalità dei cambiamenti che portano alla comparsa di tali caratteristiche dalle cellule è chiamata trasformazione e le cellule delle colture di tessuti trapiantati sono chiamate trasformate.
Un'altra fonte di linee cellulari trapiantabili sono le neoplasie maligne. In questo caso, la trasformazione cellulare avviene in vivo. Le seguenti linee di cellule trapiantate sono più spesso utilizzate nella pratica virologica: HeLa - ottenuto da carcinoma cervicale; Ner-2 - dal carcinoma della laringe; Detroit-6 - dalle metastasi del cancro ai polmoni al midollo osseo; RH proviene dal rene umano.
Per la coltivazione cellulare sono necessari mezzi nutritivi che, in base al loro scopo, sono divisi in crescita e supporto. La composizione del mezzo di crescita dovrebbe contenere più nutrienti al fine di garantire la riproduzione attiva delle cellule per formare un monostrato. I supporti di supporto dovrebbero solo garantire la sopravvivenza delle cellule in un monostrato già formato durante la riproduzione dei virus nella cellula.
I supporti sintetici standard, come i supporti sintetici 199 e i supporti ad ago, sono ampiamente utilizzati. Indipendentemente dallo scopo, tutti i mezzi nutritivi per le colture cellulari sono progettati sulla base di una soluzione salina bilanciata. Molto spesso è la soluzione di Hank. Un componente integrante della maggior parte dei mezzi di crescita è il siero del sangue degli animali (vitello, toro, cavallo), senza la presenza del 5-10% del quale non si verifica la riproduzione cellulare e la formazione di un monostrato. Il siero non è incluso nei mezzi di manutenzione.
Isolamento di virus in colture cellulari e metodi per la loro indicazione.
Quando si isolano virus da vari materiali infettivi da un paziente (sangue, urina, feci, secrezioni mucose, tamponi da organi), vengono utilizzate colture cellulari più sensibili al presunto virus. Per l'infezione vengono utilizzate colture in provetta con un monostrato di cellule ben sviluppato. Prima di infettare le cellule, il mezzo nutritivo viene rimosso e in ciascuna provetta vengono aggiunti 0,1-0,2 ml di una sospensione del materiale di prova, precedentemente trattato con antibiotici per uccidere batteri e funghi. Dopo 30-60 min. contatto del virus con le cellule, rimuovere il materiale in eccesso, aggiungere un supporto nella provetta e lasciarla in un termostato fino a quando non vengono rilevati segni di riproduzione del virus.
Un indicatore della presenza del virus nelle colture cellulari infette può essere:
1) lo sviluppo di una specifica degenerazione cellulare - l'effetto citopatico del virus (CPE), che ha tre tipi principali: degenerazione a cellule rotonde o piccole; la formazione di cellule giganti multinucleate - simplasti; sviluppo di focolai di proliferazione cellulare, costituiti da diversi strati di cellule;
2) rilevamento di inclusioni intracellulari situate nel citoplasma e nei nuclei delle cellule colpite;
3) test di emoagglutinazione positivo (RGA);
4) reazione positiva di emadsorbimento (RGAds);
5) il fenomeno della formazione della placca: un monostrato di cellule infettate da virus viene ricoperto da un sottile strato di agar con l'aggiunta di un indicatore rosso neutro (sfondo rosa). In presenza del virus nelle cellule, si formano zone incolori ("placche") su uno sfondo di agar rosa.
6) in assenza di CPE o GA, può essere impostata una reazione di interferenza: la coltura in studio viene reinfettata con il virus che causa CPE. In un caso positivo, non ci sarà CPP (la reazione di interferenza è positiva). Se non c'era virus nel materiale di prova, si osserva CPE.
Isolamento di virus negli embrioni di pollo.
Per gli studi virologici vengono utilizzati embrioni di pollo di 7-12 giorni di età.
Prima dell'infezione determinare la vitalità dell'embrione. Durante l'ovoscopio, gli embrioni vivi sono mobili, il pattern vascolare è chiaramente visibile. Con una matita semplice, segna i confini della sacca d'aria. Gli embrioni di pollo vengono infettati in condizioni asettiche con strumenti sterili, dopo aver precedentemente trattato il guscio sopra lo spazio aereo con iodio e alcol.
Le modalità di infezione degli embrioni di pollo possono essere diverse: applicare il virus alla membrana corion-allantoica, alle cavità amniotiche e allantoiche, al sacco vitellino. La scelta del metodo di infezione dipende dalle proprietà biologiche del virus in studio.
L'indicazione del virus nell'embrione di pollo è data dalla morte dell'embrione, da un test di emoagglutinazione positivo su vetro con liquido allantoico o amniotico, da lesioni focali ("placche") sulla membrana corion-allantoica.
III. Isolamento dei virus negli animali da laboratorio.
Gli animali da laboratorio possono essere utilizzati per isolare i virus dal materiale infettivo quando non è possibile utilizzare sistemi più convenienti (colture cellulari o embrioni di pulcino). Prendono principalmente topi bianchi appena nati, criceti, porcellini d'India, ratti. Infetta gli animali secondo il principio del citotropismo del virus: i virus pneumotropici vengono iniettati per via nasale, neurotropici - intracerebrali, dermatotropici - sulla pelle.
L'indicazione del virus si basa sulla comparsa di segni di malattia negli animali, sulla loro morte, sui cambiamenti patomorfologici e patoistologici nei tessuti e negli organi, nonché su una reazione di emoagglutinazione positiva con estratti di organi.
